树立成功的细胞培养空间

人体内有超过一万亿个细胞。这些整洁的包裹在精致的同步划分,差异化,变形和伸展,殴打和伸展方面进行协作。就像类似于魔幻现实主义的东西一样,这些独立生活的微小构件叠在一起,让位于一个难以想象的复杂机器:人体。然而,每个细胞内部都是一个巨大的宇宙,核心太阳位于其中心。

一百多年来,科学家们一直试图窥探这些细胞,哄骗保护良好的秘密,挖掘产生生命(和死亡)的机制。但是,如果细胞附着在体内器官上,怎么能理解细胞呢?

细胞培养以组织培养开始。科学家们砍掉了一些动物和一些器官,并试着在盘子里养了几天。**早的组织培养物由漂浮在温盐水中的鸡胚组成。这项技术是由一位名叫Wilhelm Roux的胚胎学家在19世纪后期开创的。其他人很快效仿。20世纪带来了一系列进步,**终使得细胞而不是组织被分离并保持在营养汤中。20世纪40年代带来了**个小鼠淋巴细胞系; 20世纪50年代带来了鹰的着名媒体配方以及现在备受争议的HeLa系列的建立。

今天,基本原则保持不变,但技术以极快的速度发展。细胞现在无限期地存在于孵化器内。干细胞转化为心肌细胞,这些心肌细胞在板块中敲打,或者是具有长而缠绕的轴突卷须的神经元。成纤维细胞被重编程为干细胞。忘了两个维度!癌细胞以三维(或四个,如果你加入时间成分)生长,模仿体内的肿瘤。科学家越来越接近治疗前沿,进展是惊人的。

Lee Ligon是伦斯勒理工学院生物科学系的副教授和副主任。她与细胞一起工作了将近25年,并记得她早年在替补席上引起的兴奋细胞培养。“我**次看到荧光线粒体在轴突和树突中移动 - 现在听起来很温和,但当时,它真是令人敬畏!”

Lee Lignon的实验室

Lee Ligon实验室的成员

如今,她的实验室致力于制作仿生组织培养模型,特别是肿瘤微环境模型。“我们已经开发出共培养多种细胞类型的方法,使用具有不同机械性质的不同3D ECM(细胞外基质)模型,以及这些特征的各种组合。我们现在正致力于开发一种高通量的通量方法来研究肿瘤微环境的生物力学特性。“

更复杂的设置,同样的老坏蛋

然而,尽管取得了无数进展,但仍有老敌人困扰着实验并阻碍了调查结果。这些是微生物破坏者,大胆地在细胞培养实验中建立了商店。这些是训练有素的工作人员,他们没有完全掌握无菌技术,偷工减料或忽视协议。根据科学家和专家的说法,这些是新研究人员想要获得成功和竞争力所需要的东西。

然而,尽管取得了无数进展,但仍有老敌人困扰着实验并阻碍了调查结果。

韦恩州立大学药理学副教授索科尔托迪强调,正确培训员工**关重要:“污染始终是一个问题,永远是一个问题。你可以拥有所有的花里胡哨,但是一旦你将人类引入等式,你就会遇到问题。自己培训你的员工,如果你不熟悉细胞培养,请确保找到有经验的人或在线期刊并向他们学习。“考虑阅读Geraghty RJ等人的文章,开始学习。1

同时要注意令人惊讶的污染源。例如,荧光灯可以光活化HEPES缓冲液,核黄素和色氨酸,从而产生过氧化氢和自由基。血清补充剂是生物和化学污染的常见来源。出于这个原因,**好坚持使用过去成功的特定来源和大量血清。

伪装成乳腺癌的黑色素瘤 - 为什么细胞系验证是优先考虑的问题

迄今为止,有488个细胞系被交叉污染或错误识别。记录这些细胞的数据库由国际细胞系认证委员会维护。

其中**臭名昭着的是MDA-435(或MDA-MB-435)系列。这些细胞于1975年在实验室研究中出现。从那时起,这些细胞出现在超过一千篇科学论文中,如乳腺癌细胞。然而,事实证明这是一个大问题。当科学家检查这些细胞的DNA时,他们惊呆了,发现MDA-435是黑素瘤系,而不是乳腺癌系。

期刊现在要求或强烈鼓励科学家验证他们的细胞系。2015年的自然评论呼吁科学家在这方面更积极主动,但承认共同的障碍:“如果我们排除无知和漠不关心,那么分析的成本和简单性似乎是普遍使用细胞鉴定的**大障碍。” 2

STR(短串联重复)和SNP(单核苷酸多态性)分析代表了验证细胞系同一性的可行方法。STR涉及分析遍布基因组的重复序列元素,长度为3-7个碱基对。SNP是同一物种成员之间的遗传变异,在特定基因座内是保守的,可用于确认同一性。可以获得用于SNP评估的商业试剂盒,而科学家可以将细胞发送到Promega或ATCC等公司进行STR分析。

非营利组织ATCC声称所有细胞系都在其网站上经过STR验证。此外,ATCC还推出了一个数据库,科学家可以使用该数据库将其结果与记录的人类细胞系的概况进行比较。

分析也有局限性。虽然这些方法可用于建立同一性,但它们不评估细胞纯度,即不存在种间交叉污染或污染物,例如病毒和微生物,表型,形态或细胞倍性。

康宁科学培训和教育经理Mark Rothenberg博士警告说,应该建立强有力的支原体检测计划。“支原体可以在引擎盖中的一滴液体中保持活6-8天,并且很容易污染整个设施,”他解释道。此外,虽然它与大多数实验室建立的协议背道而驰,但他表示,除非建立原始培养物,否则应考虑在培养基中不使用抗生素。“抗生素可以隐藏细菌的存在并增加污染其他培养物的风险。”他强烈推荐康宁撰写的关于如何管理污染的参考文章。3

遏制污染 - 使用技术和常识

无论空间或技术的复杂程度如何,良好的老常识都可以走很长的路。**销售代表Brian Langenderfer与DAI Scientific合作了22年。他说,他看到的**大错误之一就是在人流量高的交通区域建立了细胞培养空间。

Natalie Swartz是位于底特律的SmithGroupJJR的实验室设计师,他与大学和科学家合作设计符合他们需求的空间:“我们试图设计灵活性; 这是我们**终看到的**大创新。“灵活性意味着高度可调的轮子上的长凳。人体工程学内置于这些模块化组件中,因此科学家可以根据任务站立或坐着。

在可能的情况下,她建议研究人员专注于“三角形设计”,这意味着生物安全柜,冰箱和培养箱在战略上和附近安装,同时采取一定的预防措施。例如,“流动罩不应相互设置,因为气流会污染样品,”她说。“同样,您需要距离生物安全柜三到四英尺的设备,这样您就可以安全地取出样品。”

罗滕伯格补充说,“孵化器应放置在重型设备和电梯振动可能性**小的地方。”

所有专家都提到,在建立细胞培养空间时,您应该考虑在生物安全柜中使用哪些用品。您应该能够在不离开座位的情况下到达大部分物品。你打扰细胞周围空气的次数越少越好。

根据Swartz的说法,大多数实验室都是在20世纪70年代设计的,然后在21世纪初进行了改造。通常,较旧的实验室的设备与冰箱,培养箱和不同房间的引擎盖分开。但是所有这些运输都不好,并提供了无数的机会来妥协无菌空间。

如果您是在较老的空间中使用有限资源的众多科学家之一,您可以采取许多步骤来设计成功的细胞培养空间。

Swartz建议您在设置工作空间时考虑三个主要方面:组织,合并和上述三角形配置。“首先,组织空间。尝试通过任务合并您将要使用的所有内容。您可以创建任务区域,其中您需要的所有材料都在一个位置。使用轮子将物品移到生物安全柜,“她解释道。此外,只要有可能,您应遵循NIH指南。4

..在设置工作空间时考虑三个主要方面:组织,合并和......三角形配置。

Rothenberg回应Swartz,并解释说您可以在设施的范围内工作。有些事情无法避免。例如,如果有窗户,请确保它们已密封。

创新与使用它的人一样好

使用适当的设备也可以预防一些细胞培养事故。Langenderfer认为,如果使用得当,具有某些功能的技术可以防止很多麻烦。考虑超纯净去离子水的情况; 仅仅因为它非常干净并不意味着它应该用于每一项任务。“多年来,实验室一直在孵化器中使用去离子水,这是不推荐的,因为水会从金属中吸收离子,并且随着时间的推移会在内部产生锈斑,”他警告说。

“在引擎盖上[事情的一面],如果实验室人员使用紫外线灯替代良好的无菌技术,那么我们作为[销售]代表,无法控制这一点。然而,有一些功能,如紫外线计时器和一体式不锈钢内饰,有助于使清洁过程更快更容易,“Langenderfer说。

他继续说道,“有些孵化器没有好的控制器,因此如果实验室技术人员打开门或忘记更换湿度盘中的水,可能不会发出警报。实验室中发生的大多数事故都与研究人员对细胞培养过程的实验技术培训有关。我们对所有设备进行所有免费在职培训。我们还介绍了所有控制器的正确使用和设置。在大多数情况下,是的,如果实验室人员正确使用和维护设备,设备就很棒。“

较新的设备考虑到了科学家们的艰辛和艰苦的**。功能包括警报,可调节的高度和椅子,引擎盖和长凳的轮子,以及改进的抗菌表面。虽然整篇文章都可以写在上面,但Swartz和Langenderfer都强调了尽可能利用节能设备的重要性。如果您的部分补助金专门用于运营成本,那么这**是您需要考虑的事项。从长远来看,你免费继承的旧孵化器或引擎盖可能不值得。做你的腿部工作; “不要只购买顾问所拥有的同样的老式孵化器,”Ligon说。

Swartz警告说,一个通风橱消耗的能量与每天3.5个家庭一样多,这是一个巨大的数额。尽可能在恒定容积罩上选择可变风罩。此外,“尽可能降低窗扇,”她建议道。“如果你使用较低的窗扇或低流速罩,你可以节省高达40%的运营预算。”

Langenderfer提供了一些分离建议:“在建立细胞培养实验室或任何研究实验室时,不要只购买目录中的主要设备; 联系设备专家。**终,这将节省您的时间和宝贵的研究资金,并为您提供与您的研究应用相匹配的精确设备。“

参考

1.Geraghty,RJ等人,“生物医学研究中使用细胞系的指南”,英国癌症杂志,111(6),1021-1046,2014。[PMID:25117809 ] 

2. Freedman,LP等人,“再现性:改变细胞系认证的政策和文化”,Nat Methods,12(6):493-7,2015。[PMID:26020501 ] 

3. Ryan,J,  理解和管理细胞培养污染,技术公报,康宁生命科学。 

4. NIH设计政策和指南,研究设施办公室。 

图片:Shutterstock Images和Lee Ligon的实验室

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