细胞培养常用器材与试剂

器材与试剂 
        干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等
具体步骤
1. 水: 
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2. PBS (也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制): 
  主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗
  溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4·H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容**1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。
  移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 
3. 胰蛋白酶溶液:
       胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 
  称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。 
  用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 
4. 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液
  称取胰蛋白酶粉末(1:250) 0.05g,EDTA 0.02g,加入PBSA 100ml,0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装,于-20℃保存。
5. 青、链霉素溶液: 
  所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度**终为100单位/ml。
6. RPMI1640: 
  溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌**粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度**终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。**后定容**1000ml,摇匀。 
  安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 
  抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 
  分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 
  使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。 
7. 血清的灭活: 
  细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。 
8. HEPES溶液: 
  HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下: 
  准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容**1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装后4℃保存。 
  注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。 
9. 谷氨酰胺: 
  合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚**死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃#p#分页标题#e#下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。 
  一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 
10. 肝素溶液的配制: 
  含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中**终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为??℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。 #p#分页标题#e#
11. Ⅰ型胶原酶: 
  0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。 
12. 明胶溶液: 
  因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。shou要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌操作分装入50ml小瓶中,4℃保存。 
13. Hanks液:
       称取KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4.H2O  0.06g,加H2O** 1000ml 
  注:Hanks液可以高压灭菌。分装于4℃下保存。
14. D-hanks液:
  1液:NaCL:8.00g/L,KCL : 0.04g/L,Na2HPO4.2H2O:0.06g/L,KH2PO4:0.06g/L,配500毫升;
  2液:NaHCO3:0.35g/L,配100毫升;
  3液:酚红:0.02g,用数滴NaHCO3溶解酚红
  将2,3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4℃下保存。
15. Giemsa染液: 
  称Giemsa粉末0.5克,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90~120分钟。加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存,此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。  
器材与试剂 
        干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等
具体步骤
1. 水: 
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2. PBS (也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制): 
  主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗
  溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4·H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容**1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH调PH到7.4。
  移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 
3. 胰蛋白酶溶液:
       胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 
  称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。 
  用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。 
4. 0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液
  称取胰蛋白酶粉末(1:250) 0.05g,EDTA 0.02g,加入PBSA 100ml,0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装,于-20℃保存。
5. 青、链霉素溶液: 
  所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。 分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度**终为100单位/ml。
6. RPMI1640: 
  溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌**粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度**终各为100单位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。**后定容**1000ml,摇匀。 
  安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 
  抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 
  分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 
  使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。 
7. 血清的灭活: 
  细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。 
8. HEPES溶液: 
  HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。 
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下: 
  准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容**1L。0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装后4℃保存。 
  注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。 
9. 谷氨酰胺: 
  合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚**死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。 
  一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 
10. 肝素溶液的配制: 
  含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中**终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为??℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。 
11. Ⅰ型胶原酶: 
  0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。 
12. 明胶溶液: 
  因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。shou要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌操作分装入50ml小瓶中,4℃保存。 
13. Hanks液:
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       称取KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4.H2O  0.06g,加H2O** 1000ml 
  注:Hanks液可以高压灭菌。分装于4℃下保存。
14. D-hanks液:
  1液:NaCL:8.00g/L,KCL : 0.04g/L,Na2HPO4.2H2O:0.06g/L,KH2PO4:0.06g/L,配500毫升;
  2液:NaHCO3:0.35g/L,配100毫升;
  3液:酚红:0.02g,用数滴NaHCO3溶解酚红
  将2,3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4℃下保存。
15. Giemsa染液: 
  称Giemsa粉末0.5克,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90~120分钟。加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存,此为Giemsa原液。 使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。   1 冷冻管应如何解冻? 
取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO? 
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, jue大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

3 可否使用与原先培养条件不同之培养基? 
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类? 
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? 
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响? 
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7 何时须更换培养基? 
视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素?
除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。