细胞培养操作指南

1,原代细胞培养
原代培养需要严格要求:(1)取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤,需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶(4)由于原代培养组织细胞的存活率很低,故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。(5)营养丰富的培养基比单一的培养基更可取,如果要添加血清,胎牛血清比牛马的血清更好。(6)对于取材部位易于感染(如皮肤)应先用70%乙醇消毒,在无菌条件下切除组织,尽快转移入BSS或培养基中。不要再培养室取材,因为动物可引入微生物污染。若必须推迟,可保存在4℃,72h。
1. 剪切组织 
先将所取得的组织,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后,用手术剪将组织剪成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状,约1mm3大小。静置片刻后,用吸管吸去上层液体,加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离 
消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞,以利于进一步的培养,常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养
    细胞悬液用计数板进行细胞计数,用培养液将细胞数调整为2~5×105 cells/m1,或实验所需密度。分装于培养瓶中,使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内,5%CO2,37℃静置培养。一般3~5d,原代培养细胞可以粘附于瓶壁,并伸展开始生长,可补加原培养液量1/2的新培养液,继续培养2~3 d后换液,一般7~14 d可以长满瓶壁,进行传代。 
注意事项:
  1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因,必须加强各个环节的无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般是很难消除。 
  2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同,对培养液的要求有一定的差异,必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
  3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后,就保持应用**实验完成。
  4. 胶原酶溶液 必须新鲜配制,贮存时间过长(即使是-20℃低温保存),也将影响消化效力,导致消化时间过长,细胞损伤增加。
  5. L—谷氨酰胺 几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞会因生长不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不稳定,加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时,就应重新加入原来量的谷氨酰胺。
  6. 静置培养 原代细胞在消化分离后,置于CO2培养箱的头24-48h (必要时72 h)内,应处于**静置状态,切忌不时地取出培养瓶观察生长状况,这将使原代分离细胞难以贴壁,更谈不上伸展和增殖。这对初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成份会消耗光,在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。
  7. 消化时间 一般消化**肉眼尚可见微小组织颗粒即可,因为此时组织颗粒已经松散,略经吹打即成细胞团或单个细胞,过久的消化往往导致细胞损伤加重,细胞培养成活率降低。
  8. 其它生长因子经过以上处理,一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子。如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外,内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用,但费用较高。
            原代外植(组织块培养)
简介:组织切碎并清洗,组织块接种于培养瓶或皮氏培养皿的表面,加入少量含高浓度血清(40%-50%)的培养基,表面张力使标本保持原位,直到他们自发地贴附于表面,随后细胞开始生长。此方法适合小量组织培养,如皮肤活检组织,为了尽可能减少细胞损失,而不用酶或机械方法。
操作流程:切割→细切→沉淀清洗→清洗后用吸管转入培养瓶→倾斜培养瓶吸出平衡盐溶液→然后加入一薄层培养基→培养2-3w,
无菌材料:培养基(DMEM与F12等体积混合,再加20%胎牛血清);100ml的DBSS;9cm皮氏平皿,非组织培养级别;尖头镊子,尖头手术刀;100ml广口移液器;15或20ml离心管;25平方厘米的培养瓶或5厘米的皮氏培养皿,大约100mg组织用5个25平方厘米的培养瓶。开始每瓶放1ml培养基,随后3-5天每瓶加**5ml.
操作步骤:
    1,将组织移入新鲜无菌BSS浸洗
        2,移入第2个培养皿切除多余组织,如脂肪或坏死组织,用手术刀交叉切成约1mm3的小块。
        3,用移液管(先用BSS浸润,否则组织块易贴壁)将组织块移入15或50ml离心管或普通容器中,让组织块静置沉淀。
        4,用BSS重悬冲洗组织块后静置,去除上清液,重复两次或更多

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