软骨细胞培养

实验方法
Ø 各种溶液的配制
1、  配制D-Hanks液(无钙镁)1L,PH8-9
(1) 称量Nacl8.0g,kcl0.4g,Na2Hpo4.H2o 0.06g, kH2po40.06g, NaHco30.35g,酚红0.02g
(2) 依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
(3) 用5.6% NaHco3溶解酚红0.02克。
(4) 将酚红液(3)加入(2)中。
(5) 补加水**1000ml,混匀。
(6) 将Hanks液分装盐水瓶内,110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟,4℃冰箱保存备用。
 
2、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
 (1)称取胰蛋白酶187.5mg,用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
   (2)补足Hanks液**75ml,搅拌混匀,置40℃水浴搅拌帮助溶解。
   (3)冷却**室温后,置4℃冰箱过夜。
   (4)用滤纸粗滤,再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
   (5)分装小瓶,低温冰箱冰冻保存备用。
 
3、 配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml
(1)称取Ⅱ型胶原酶150mg,用D-Hanks液溶解。
(2)补足Hanks液**49.5ml,搅拌混匀。
(3)用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
(4)分装小瓶,低温冰箱保存备用。
 
  4、 配制闪烁液
(1)用电子天平称取POPOP 0.2g,PPO 2.0g。
(2)将上二者溶解在500ml二甲苯中,避光保存,备用。
 
Ø 取材与培养
(1)取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自首都医科大学动物房),兔耳静脉注射5ml空气致死。
(2)无菌条件下取双侧下肢膝,髋关节面软骨,置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎**1mm3大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
(3)吸去漂洗液,加入0.25%胰蛋白酶溶液,并置入37℃、5%CO2孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
(4) 吸出胰蛋白酶溶液,加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液,置入37℃、5%CO2孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液,离心2000rpmX10min,去除上清液。
(5) 用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次,以同样方法再离心一次。
(6) 过120目纱目,去除上清液。
(7) 用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液,调细胞悬液浓度**7.5X104
(8) 将细胞悬液接种于24孔培养板(1ml)及96孔培养板(200μm)中,24孔板及96孔板各2板。
(9) 置于37℃、5%CO2孵箱中培养48小时。
 
Ø 更换部分培养基
(1) 用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基,更换同等数量新的培养基。
(2)同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基,更换同等数量新的培养基。
 
Ø 加药
按照预前设计给培养孔中加A药(牛膝健步)及B药(鹿茸生长素),具体加药方法如下图。
具体加药情况
    每支鹿茸生长素加1mlDMEM稀释,PH7.0 (DMEM  PH7.2)
  药  品 培养板  大剂量  中剂量   小剂量
A药(牛膝健步) 96孔板  10μl   8μl    6μl
A药(牛膝健步) 24孔板  50μl   40μl    30μl
B药(鹿茸) 96孔板  30μl   20μl    10μl
B药(鹿茸) 24孔板  150μl   100μl    50μl
鹿茸大剂量的浓度为0.12%,中剂量的浓度为0.08%,小剂量的浓度为0.04%。
测定
Ø II胶原的合成
关节软骨细胞DNA的合成用3H TdR的掺入量来检测。
3号板加药后48小时加同位素3H TdR及3H脯氨酸
(1)用1ml注射器抽取0.1ml 3H TdR (即0.1μci)(3H TdR及3H脯氨酸购买时浓度为    1mci/ml)。
(2) 加DMEM**0.5ml,将3H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
(3) 同法配制相同数量的3H脯氨酸。
(4) 根据试验前设计,按每孔5μl(即1μci)的量加入同位素。
(5) 置于37℃、5%CO2孵箱中培育12小时。

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