Marc-145细胞培养

细胞消化传代
Marc-145细胞培养48-72小时后,将细胞用0.2%的胰酶消化后以1:3的比例传代。细胞培养液(6%小牛血清、1%双抗、93%DMEM培养液),细胞维持液(3%小牛血清、1%双抗、96%DMEM培养液)。
细胞冻存(15ml中号培养瓶)
将细胞形态较好,细胞活力旺盛(即传代后36-48小时细胞长成单层面)用0.2%的胰酶
消化后加入细胞冻存液20ml(30%小牛血清、10%二甲基亚砜DMSO、60%DMEM培养液),混匀后2ml/管分装,放入细胞冻存盒置-70℃冰箱72小时后放入液氮罐保存。
细胞复苏
将液氮罐中的细胞快速取出,置37℃温水中解冻,再将解冻后的细胞1000转离心5分钟,在无菌操作台内小心倒掉上清,加入1ml细胞培养液后吹打混匀,吸入到5ml细胞培养瓶内,在加入5ml细胞培养液。
 
 
marc 145细胞培养的简单综述
2008-07-25 00:00   来源:丁香园   点击次数:1930 关键词: marc 145细胞 细胞培养 综述
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一、 细胞及培养
 
1、Marc145细胞
 
上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到,可连续培养。
 
2、生长培养基
 
DMEM(高糖型,含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺,和110mg/L丙酮酸钠,不含碳酸氢钠)+5-10%新生牛血清+ 1%双抗(青霉素和链霉素)的培养液。
 
3、冻存液
 
生长培养基+10% DMSO
 
4、细胞健康生长的几项注意事项
 
(1)细胞没有支原体等外源因子的感染。
 
(2)培养液的pH值可在7.0-7.3,以7.2为佳。
 
(3)一般按1:3传代,细胞接种密度为1-1.5×105cells/ml,48hr后长成单层。
 
(4)培养基和血清的质量可靠、稳定;建议采用特级小牛血清。
 
(5)细胞及时传代,不可以在老化后传代,一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
 
(6)细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA,消化过程应尽量缩短在1~2分钟内完成。
 
二、 病毒感染、维持和收获
 
转瓶中细胞长成单层后,弃瓶内细胞生长液,接种PRRS病毒。37℃吸附1hr,加入维持液,置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3-5天。
 
维持液:DMEM+4~5%新生牛血清。
 
pH应为7.4~7.8;后期维持pH会慢慢降下来。
 
细胞病变时间出现在接毒后48小时,72~96小时细胞病变达80%左右,当细胞出现80%以上病变(CPE)时,即可开始收毒;反复传过几代后病变时间可缩短。
 
第3、4天注意观察,细胞病变(CPE)达到80%时收获病毒,-20℃冻融3次,混匀病毒悬液,96孔板测定TCID50。
 
收液时需要将含毒细胞反复冻融2~3次以破碎细胞,将病毒释放到培养液中。
 
三、 细胞病变(CPE)
 
细胞在接种病毒后,24-48hr开始出现病变,72-96hr约达到80%病变。病变现象:细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落,再大片脱落,**后整个细胞裂解、破碎。图1是指PRRSV感染后,出现细胞病变的Marc 145细胞。
 
四、 PRRS病毒在细胞中增殖规律( Virology Journal, 2006, 3: 90)
 
PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段,**阶段:病毒感染细胞后的20-22hr左右,仅部分细胞被随机感染,而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)与MOI量无关,因为MOI剂量比常规量提高100倍,感染22hr后,仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段:感染后的2-3天(也称为病毒的对数感染期),病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染,细胞对自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus),并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。
 
对我们的一点启示:可以采用适当低量的MOI进行病毒感染,比如0.05virus/cell;同时,大部分细胞在维持期的**天尚需继续生长,而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰,较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资,可以相信:维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。
 

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