昆虫sf9细胞培养

Sf9培养要点:
温度:27-28摄氏度
pH:,sf9**适的pH6.2,随培养时间的延长,Ph值会增加
传代时间:72h(三天左右)
细胞来源:Sf9(货号B825-01)和Sf21(货号B821-01)细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系,源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系,来源于秋蝇蠕虫(草地夜蛾)蛹的卵巢组织。(以上来自invitrogen)
细胞特点:规则的带有颗粒球形。贴壁紧。
标准条件的定义:
培养**低密度:0.6/ml(健康对数生长期细胞活率**少应不低于90%。活率低于90%细胞不是在**佳条件下培养不能用于实验)1×/mL将出现对数生长状态
 
传代培养:传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和**大活率。
 
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层(如下定义)然后1:5(细胞体积:**后培养基体积)稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养
 
悬浮培养:在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整**0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。
 
Sf9悬浮培养所需要的细胞数
培养基:sf-900 Ⅲ SFM(添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量)
培养瓶与培养体积:
 
冻存:一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90%活率和80-90%融合的要求(如:低代次)推荐冻存几管。当融解细胞,它将会达到**佳使用状态。
 
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养;
2. 将无菌冻存管立于冰上,做好标记;
3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞;
5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中;
6. 置于-20℃1h,然后移**-80℃24-48h;
7. 储存于液氮中。
 
转染的细胞:需要的是对数期的细胞>95%发育能力,可以完成成功的转染。
载氧:对于**优生长条件和蛋白的表达,昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的区别:一般推荐Sf900II来大量表达蛋白
 
Sf900II含有表面活性剂(剪切力保护剂(保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害))
 
当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时,注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂,因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养的一般顺序:复苏——传代——传代稳定——冻存
应当遵循的一般过程:复苏——贴壁培养——悬浮——悬浮扩大培养(产生目标蛋白)
(也可不经过贴壁培养,直接悬浮培养)
贴壁时间:45min
悬浮的转速:80rpm
附:离心机rcf与g的换算:
 
 
无血清培养基可以选择性加入一定的抑菌剂防止细菌或者真菌污染:
培养基:GIBCO-SFM900
      加青霉素链霉素抑制细菌生长两性霉素B抑制真菌生长
 

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