细胞培养常见污染


细胞污染的类型
一、细菌污染
    细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染。 一开始就要十分重视,防止污染,否则会前功尽弃,不仅浪费时间,而且浪费人力、物力,甚**造成无法弥补的损失。即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。**常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。
    培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变而呈现黄色。也有的 培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,**后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。一般细菌污染进程很快,大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。

二、真菌污染
    真菌污染是细胞培养过程中**常见的一种,尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。**常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
    培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间(发生卵圆形物体污染的几率很大)。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但**后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

三、支原体污染
    支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的**小微生物,**小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
    培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。

四、病毒污染
    采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

五、非同种细胞污染
    由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的,而现在却认为是HeLa细胞。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。
    非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。


污染来源及鉴别
一、污染来源
细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径:
1、不洁的动物组织标本
很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外),但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌,如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡,也会带菌,造成细胞污染。
2、空气
空气中含有大量的微生物,如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,净化工作台使用过久,滤板未定期更换或长久不更换,滤气受尘埃堵塞,工作时不带口罩或外界气流过强,污染空气进入操作区,也会导致污染。春夏季南方地区多雨,空气湿度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培养用物品、材料洗刷不净,培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。
4、操作
来自操作者的污染主要有以下几方面:
1、器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过,或者是否已经消毒灭菌处理过,或者虽经处理,时隔已久又末重新处理。
2、操作者未戴口罩、帽子,呼出气中排出细菌和支原体。
3、培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。
4、操作者不当心,动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品,如手上皮肤和瓶子外壁等。
5、细胞倾液时倒出培养瓶或者滴落在超净台上,未及时擦净或者灼烧。
6、灼烧的火不够旺。
7、移液管吸取液体时将空气中的气流吸入培养瓶中。
8、长时间的将离心管放在离心机中,可能由于口没有完全封闭而造成污染。
9、同一根吸管或者放置吸管的离心管长时间使用造成的一管污染多瓶细胞交叉污染。
10、操作者操作时大声说话,来回走动扬起灰尘等。
5、血清,市售血清灭菌不彻底,潜在病毒和支原体污染。

二、污染的鉴别