细胞培养方法

2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 

将1.2%低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6%的底层琼脂,6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固,取对数期细胞,胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数,并调细胞浓度为10000 个/ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合,制备0.3%的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液(约1000cell/well),混匀,室温凝固。置于37℃,5%CO2 的细胞培养箱中培养2-3 周,计数含50 个细胞以上得克隆,计算细胞集落形成率,SpotII 采集图像。
2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解 

细胞以每孔3000个接种**96孔板,分成不同组,每组3孔,利用含有10% 胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后,向培养液中加入一定工作浓度的药物(单体或混合物),继续培养24 h或48h。培养结束,直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl,孵育2-4小时(应常在显微镜下观察)。去除培养液,每孔加入DMSO 100μl,充分振荡3分钟,立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。
由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性,因而加入MTT之后应该在显微镜下观察,药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。
另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法,但是都要考虑药物对细胞ATP是否有影响。
所以测定细胞增殖,**简单,**原始,**麻烦的方法,进行细胞计数我们感觉还是**好的方法。
细胞培养方法
哺乳动物细胞培养规则:
1,  严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞,由于细胞为整合生物中心共用,使用紧张,在使用时尽可能提高速度,保证操作规范。
2,  使用细胞间之后,主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。
3,  在自己培养细胞出现污染之时,及时通报同一培养箱培养细胞者,并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室,以减轻对细胞培养的影响。
4,  实验所用细胞培养原则要求:A,细胞复苏之后两代开始使用;B,保证细胞每次传代前密度不超过90%;C,细胞使用**多12代(约2个月)。
5,  **好每天观察细胞生长状态,若有异常及时处理。
6,  具体参照www.atcc.org中细胞培养要求。
 
细胞传代方法
1,  将长**80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2,  加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。
3,  瓶口用瓶盖盖好,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆   形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。
4,  用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,尽可能的避免气泡产生,分到另外两到三瓶中,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
5,  细胞培养液参照www.atcc.org,一般含有10%胎牛或小牛血清。
96/24孔板传代:
1,  前同于普通细胞传代方法。
2,  细胞吹打均匀后,对细胞进行计数,根据需要调**适当浓度。例如:每孔传代10000个细胞,可以将细胞调**浓度十万,之后利用排枪,吸取100ul,**96孔板中。
3,  24孔板,采用1ml移液器进行传代。
 
细胞冻存方法
 
1,  预先配制冻存液:含90%FBS,10%DMSO的冻存液,DMSO液用培养液配好,避免因临时配制产热而伤害细胞;
2,  取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1×106 ~ 5 ×106细胞/ml);
3,  加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。
4,  放于程序降温盒,之后在-80℃冰箱过夜。
5,  将程序降温盒中细胞放于液氮保存。
6,  要保证冻存细胞数量。
 
细胞复苏方法
1,  从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38 水浴中,不断摇动使其融化(1分钟左右);
2,  尽快用培养液稀释**原体积的10倍以上;
3,  低速离心10分钟,1000转;
4,  去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
5,  尽快对复苏细胞进行换液。
6,  扩大培养后,再冻存**少复苏数量的细胞,以保证细胞库的完整。
 
细胞计数
1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净,并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:细胞数/ml=4大格细胞总数/4×10000
 
实验前准备下列物品:双蒸水 瓶子(500ml、250ml),离心管,tip头,Eppendorf管,滤纸,餐巾纸,微量加样器20-50µl。  具体实验步骤如下: