细胞培养常见问题及解答

1.如何选用培养基?
    培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,**MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的**是AIM V培养基(SFM)。 
2.为什么要热灭活血清?
    加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。 

3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗? 
    L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有**终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定? 
    GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。
    GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有**小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红? 
    酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞? 
    用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染?
    当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
    高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别? 
    HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测 
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么? 
    二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗? 
    是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育**少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。