新的定量细胞培养和梯度迁移测定

新的美国**申请:定量 细胞 文化 与梯度迁移实验。
 
被动和活跃的细胞迁移是生物学中的重要细胞过程。 细胞迁移在生殖,胚胎发生,干细胞生物学,伤口愈合,免疫防御,组织修复,组织再生,组织重塑和实际上在活组织和器官的所有活动中是必需的。 恶性肿瘤的威胁演变,其中细胞能够侵入解剖限制(恶性侵袭和转移),鼓励对细胞迁移机制和控制的强烈研究,因为这些是肿瘤侵袭和肿瘤转移的关键组分。 在这一领域,有利于或损害细胞运动的因素的知识正在审查使用几个体外模型的细胞迁移通过凝胶结构(3)或穿越纯分离的实际基底膜(4)。 通过体外屏障限定细胞迁移的常见定量变量是时间,阻挡层厚度/组合物,即得逞擅屏障细胞的数目,所需的细胞的细胞(5)和时间的初始和**终位置之间的距离群体侵入确定的细胞培养间隙(体外伤口愈合试验)(6)。 

这些类型的测定在药物筛选,毒性评价和细胞生物学研究中是重要的,并且通常由研究者组装在一起的市场中独立提供的多种装置和产品的自制安排来执行。 **近,来自EMD Millipore公司的一组发明人申请了题为“Cell Culture and Gradient Migration Assay Methods and Devices”(US 20130171682 A1)的**,其实际上增强和改进了公知的“Millicellμ-迁移测定Kit“来自同一公司。
该**申请描述了基于形成用于培养和定量侵入性活动细胞的系统的微流体装置的各种组件的即用型紧凑组件。 本发明引入新颖的微流体细胞培养溶液,其允许培养基没有湍流流动,避免细胞微环境的干扰。 该解决方案比以前使用的测定法具有明显的优点,使用多培养室板,另外在良好限制的细胞培养室和观察下特定限定的“侵入室”之间提供合适的分子梯度(参见图1)。 

所提出的装置允许使用被动重力驱动流(通信花瓶基础)长期连续灌注细胞培养物,并允许在显微镜和时间图像记录下在侵入室上直接细胞分析。 帧记录后的帧允许使用计算机驱动的评估具有特定软件的细胞的侵袭行为(见图2)。 

该设备的基础简单而坚固:

1。        使用经典的微量移液管和吸头将具有特定添加剂的培养基引入孔(流动入口)。 流入口与具有毛细管网格的附件孔(流出口)连通,所述毛细管网格策略性地抑制介质从入口到流动通道的流动,并且从该通道到流出口。 通过控制前流和流速,测试的持续时间可以延长(**多4**5天),一起提供细胞应答的生理时间。 所有具有低量的培养基和试剂降低了研究的特定分子的成本和需要。 CELARTIA-BLOG-PATENT-MILLIPORE-3

2。        基质胶,胶原蛋白,纤维蛋白或他人的凝胶状物,含有分散细胞,在“加载频道”,一个狭长室装(100×4×2微米(长×宽×高),并行尺寸段的“流动通道”,并通过具有约4微米宽的狭缝的“扩散屏障”与其分开,所有这些都设置在单个块中.100×50μm(W×H)流动通道从流动入口扩散的营养物质通过灌注屏障并且供给细胞,该流动通道模拟体内血液流动。在一个具体的实例中,在本申请中报道,作者声称重力驱动流速设定为约20μl/天,允许超过3天连续流动实验,而不重新填充孔。

3。        在加载通道和流体通道之间,空腔限定更大的室,“侵入室”通过屏障与主加载通道隔开,“侵入屏障”为细胞的被动随机扩散提供一定的阻力装载通道进入侵入室。 这种布置允许在迁移室的末端处的测试介质的**更新,因此在迁移屏障和扩散屏障之间保持恒定的趋化梯度。 
总之,“侵入室”由加载通道(尺寸约为4.8×0.5×0.05mm(L×W×H))和其流路外侧的扩大形成,仅被“侵入屏障”分开,具有4微米宽的狭缝。 在入侵屏障的相对侧上存在另一个屏障,即将侵入室与流动通道分开的“扩散屏障”。 

4。        将含有细胞的凝胶通过毛细管流或使用其它主动注射装置如微量移液管或具有**的注射器装载到装载通道中。 凝胶通过通道朝向通过入口屏障并排穿过的流出口流动,填充入侵室,但保留通道中大于20微米的细胞。 CELARTIA-PETAKA试验迁移微孔2

5。        在装置温育期间,细胞通过侵入屏障主动迁移到侵入室中,其通过溶解在通过流动通道循环并且通过扩散屏障扩散进入凝胶的培养基中的分子的增加或减少的浓度激活。 

6。      侵入室的底部和顶部是透明的,这允许细胞侵袭进程的显微观察和记录在时间圈数字视频的过程。 可以在帧之后对这些时间圈序列进行分析,并通过测量运动的距离和方向来测量细胞位移。 这两种类型对浓度**高或**低浓度的细胞位移与足够的计算软件如的 Image J软件 ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )中,加入所有正和负轨道和结果统计比较。 为了区分朝向从随机迁移chemoatractant趋化性,运动被在x方向)单独分析(垂直于梯度从y轴(平行于梯度)运动。 使用从迁移图,从侵入屏障细胞的**终位置总迁移距离与欧几里得距离,相对于梯度条件下计算的迁移距离也可以计算 (7) 

7。      客观数据获取,简单性和鲁棒概念是发明人要求保护的基本优点,但是重要的是,它们还要求该系统在自动系统中容易变换的适用性。 他们提出了基于相同原理的允许在单个设备中测试不同的单元和条件的多个布置。

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