细胞培养的应用

**节   细胞培养在分子生物学中应用
 
    分子生物学是在生物化学、遗传学、免疫学、微生物学、细胞生物学、生物物理学等学科结合的基础上,经过相互杂交、相互渗透融合发展起来的一门新兴学科,它从分子水平上研究生命现象的本质以及活动规律,以达到造福人类的目的,主要侧重于研究基因的结构和功能、分子间信号传递和调控。
    基因在细胞中的表达在时间和空间上具有高度的特异性;细胞的运动、迁徙、粘着、分化的控制机制需要从分子水平上阐明;肿瘤的发生和发展的机制有待于深入研究;人类基因组计划已于2000年6月完成人类基因组草图,科学家发现人类基因数目约为3万个左右,仅比果蝇多2万个,远少于原先10万个基因的估计。2003年4月14日,国际人类基因组测序组织正式对外宣布:美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图,人类基因组计划的所有目标均已实现。目前基因功能比较清楚的有10 000条左右,还有大量的基因功能不明;基因的功能需要以细胞为载体,细胞为这些研究提供了研究的对象和材料。
    鄂征等将以研究体外培养的细胞为主要研究对象的分子生物学技术,称为分子细胞学技
术。细胞是由多种生物大分子如核酸、蛋白质、类脂等组成并由它们行使各种功能活动,只有通过对它们的研究,才能了解细胞的基本活动规律。
对其的研究技术可以分为三类,一是分离提取研究;二是基因导入研究;三是原位检测研究。
 
                        一、分离提取研究
 
    根据分离物质的种类分为DNA提取、RNA提取、蛋白质提取。
    1.DNA提取  在分子生物学研究中,DNA是这些技术应用的主要对象,所以从真核细胞中分离DNA是分子生物学研究中很重要的基本技术,DNA样品的质量直接关系到实验成功与否。真核细胞95%的DNA存在于细胞核中,DNA与蛋白质结合在一起,构成染色质的**结构,另有5%存在于细胞器(线粒体)中。提取DNA的方法比较多,但基本原理是一样的,即去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类生物大分子,去除其他不必要的核酸分子,沉淀DNA,去除盐类、有机溶剂等杂质,**后纯化核酸。
    方法一:酚抽提法
   【材料】
    磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4),DNA抽提缓冲液,10mmol/L Tris-Cl(pH8.0),0.1mol/L ED-TA(pH8.0),20μg/ml RNase A,0.5%SDS,蛋白酶K 20mg/ml,酚(Tris-C1 pH8.0,饱和),NH4Ac 10mol/L,TE(10mmol/Tris-Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0)),无水乙醇。
   【操作过程】
(1)收集细胞,对于悬浮培养的细胞可以直接经1500g离心,用PBS洗涤一次,再次离心去上清;对于贴壁培养的细胞,用胰酶消化后再离心收集,用PBS液洗涤一次后,再次离心,弃上清,收集细胞。
(2)在有细胞沉淀的离心管中加入DNA抽提缓冲液l0ml,37℃ 1小时。
(3)加入50μl 20mg/ml的蛋白酶K,50℃保温3小时。
(4)加入等体积的酚,上下颠倒混匀,直**水相与酚相混匀成乳状液。
(5)室温,5000g离心15分钟,将水相转移到另一离心管中,重复酚抽提二次。
(6)转移水相,加入0.2倍体积的10mol/L NH4Ac,2倍体积的无水乙醇混匀,可立即看到乳白色丝状沉淀,弃去上清,立刻用70%乙醇漂洗沉淀。
(7)室温,5000g离心5分钟,弃上清,室温让乙醇挥发干净。溶于适量的TE中。
(8)测定DNA的含量和纯度。
【注意事项】
(1)此法可以用于提取5×107个细胞,可得产量为200μg。
(2)高分子量DNA提取过程中,取上层DNA,往往会牵动水相与酚相的界面蛋白质层,可以将Tip头剪去一段,这样**的口径增大,缓慢吸取水相。
(3)在DNA抽提缓冲液中加入高浓度的RNase A,可以省去DNA沉淀后再次用RNaseA消化残留的RNA。
(4)此方法可分离100~200kb左右的基因组DNA,适用于λ噬菌体作为载体的基因组文库的构建、脉冲场电泳、酶切分析、Southern杂交、PCR检测等实验。
    方法二:甲酰胺解聚法
【材料】
    DNA抽提缓冲液:10 mmol/L Tris-C1(pH8.0),0.1mol/L EDTA(pH8.0),20μg/ml RNase A,0.5%SDS。蛋白酶K 20mg/ml。变性缓冲液:80%去离子甲酰胺,0.8mol/L NaCl,20mmol/Tris-C1(pH8.0)。透析液1:0.1mol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl(pH8.0),l0mmol/L EDTA(pH8.0)。透析液2:10mmol/L NaCl,l0mmol/L Tris-Cl(pH8.0),0.5mmol/L EDTA(pH8.0)。
【操作程序】
(1)细胞的收集及蛋白酶K消化同酚抽提法。
(2)当蛋白酶K消化后,将溶液冷却**0℃,加入10ml变性液缓冲液,放置15℃过夜。
(3)将液体转移**1个火棉胶袋中,先用透析液1透析,每次1L,换液4次;然后用透析液2透析,换液6次,每次700ml。
(4)直到DNA溶液中A260/280的值稍大于1.75,若低于1.75则需继续透析。
(5)根据0D260计算DNA的含量,用脉冲场电泳分析DNA分子量的大小。

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