细胞传代培养操作流程

细胞复苏:
1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温,回温后喷以75%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。如配置:50mL完全培养基(含10%FBS,1%青链霉素双抗)
44.5mL基础培养基 + 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。
2. 戴防护手套后,自液氮罐中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,立即放入37℃水槽中快速解冻(避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡),轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化,以75%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内,再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10),混合均匀,放入37℃,5%CO2恒温培养箱中培养。取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。(Sf9细胞在27℃生长,可不需CO2)
4. 一般而言,细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。若要立即去除,则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内,离心1300rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
传代培养:
1. 37℃恒温培养约48小时,待细胞长满80-90%后,从培养箱取出75cm2培养瓶,倒掉培养基。加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清,倒掉缓冲液。
2. 沿壁(无细胞的一面)缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min,轻轻摇晃,倒掉残余胰酶,将培养瓶置于恒温箱中约1min,拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。
注意:**佳消化温度是37℃,加液后用移液管反复吹打分散细胞。
3. 向瓶中加入5mL完全培养基,反复吹打均匀2min,从中取出20μl**0.5ml小离心管中,向管中加入80μl台盼蓝溶液,混匀,从混合液中取出10μl**盖好盖玻片的计数板上,计算细胞密度及活率。
4. 将5mL细胞悬液全部吸出,分别接种1mL悬液到原培养瓶和另一新的培养瓶中,其余舍弃。再向两瓶中各加入10mL完全培养基,置于CO2培养箱培养。(细胞传代时按1:5或更大比例稀释)
细胞计数与存活测试:
1. 取10μl混合液自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色。
2. 计数四个大方格的细胞总数。计数板计数时,**适浓度为5~10×105细胞/ml。高浓度细胞悬液,可取出部分稀释后计数。
3. 每一大格的体积为0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若细胞位于线上,只计左线与上线的细胞。
注:细胞密度= 四大格细胞总数×稀释倍数×104/4= 细胞数/ml;
细胞活率= 活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。
                         
                          
                          
细胞冻存:
1. 冷冻前确保细胞处于指数生长期,传代后的5mL细胞悬液取出1mL接种到培养瓶继续传代。另取一无菌离心管,将剩余4mL细胞悬液置于其中,离心1000rpm,5min(转速勿超过1500rpm)。
2. 离心后倒掉上层清液,收集下层细胞沉淀。向离心管中加入900ul完全培养基,用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率。一般细胞浓度为2~5×106cells/ml较适宜。
3. 将细胞悬液转入1.5mL无菌冻存管中,再加入100ul试剂级DMSO,混匀,制成细胞冻存悬液(DMSO**后浓度为10%)。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期,然后进行冻存。
注意:对Sf9细胞而言,冻存比例为:95%培养液+5%DMSO
4. 传统方法:冷存管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16~18小时(隔夜)→液氮罐长期储存。(-20℃勿超过1小时,防止胞内冰晶过大造成细胞死亡)

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