细胞培养完整手册

常用设备 
准备室的设备:
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品柜(放置消毒过的物品)、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、 PH 计(测量培养用液 PH 值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。
培养室的设备: 
液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱( -80℃ )、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。
必须放在无菌间的设备:
离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4℃ 冰箱(放置 serum 和培养用液)。
无菌操作基本技术 
无菌室的灭菌:
1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用 3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 %过氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱(培养箱)灭菌:先用 3‰ 新洁尔灭擦拭,然后用 75 %酒精擦拭或者 0.5 %过氧乙酸,再用紫外灯照射。
3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。
4.实验后灭菌:用 75 %酒精( 3‰ 新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
5.定期检测下列项目:钢瓶之CO2 压力;CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换);无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。
实验人员的无菌准备:
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用75 %酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示: 
1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 %酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。
器械的清洗和消毒 
玻璃器械洗消: 
一、新的玻璃器皿的洗消: 
1.自来水刷洗,除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入 5 %稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干: 12 小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g :浓硫酸 200ml :蒸馏水 1000ml )浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次,**后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。
5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。
6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向 15 磅 时,维持 20-30 分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消: 
1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。
2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液), 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗 3 次。
3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向 15 磅 时,调节电开关维持 20-30 分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)
5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用 75 %酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压( 30 分钟)消毒,再烘干备用。
橡胶和塑料: 
橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:
1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2.胶塞烘干后用 2 %氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟(用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。**后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。
3.胶帽,离心管帽烘干后只能在 2 %氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。**后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。