293细胞培养

1.培养基DMEM  ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素
2.复苏:
(1)37度融化后,擦干冻存管 酒精擦,细胞加入15ml离心管,加5ml培养基,500g离心5min,弃上清,加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中,5~6ml左右,记得晃匀。
3. 传代  吸出旧培基,加5mlPBS洗1-2遍,用移液管加1ml胰酶,滚2遍吸出,37度放1min左右计时,看到变圆即加入新培基吹打 ,几下就好了,分到新瓶里。
 
我个人认为:293细胞贴壁后形成圆形,可能是细胞本身状态不是很好,细胞不够饱满,细胞的贴壁后的棱角不易显露出来,所以看上去类似圆形,而且细胞较小。 
293细胞是用5型腺病毒75株系转化,含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系,是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,表现出典型的腺病毒转化细胞的表型,细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞的大规模培养方式有三种:贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长,也可生长在血清浓度降低的培养基中。单层培养细胞在5-10%FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲,1:10传代后,一周可以长满。严禁过度生长,这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积,影响病毒斑的形成和转染,传代时也不易打散。悬浮的293细胞很容易大规模培养,但不容易长期保持稳定。293细胞在传代120次以后,其表型可能改变,生长状况不再完全是单层的了,偶尔会形成局部的细胞成团聚集,应立即抛弃,重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性:
 1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9~7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代:倒去废液,PBS洗一次(轻),用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化,生长良好细胞,培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s,然后吸去,再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化,反复吹打**细胞全成单个悬浮细胞即可。12小时-24小时90%以上细胞贴壁。293细胞传代时机为达80-90%汇合,传代比例为1:3。
3、293细胞在低代时容易贴壁,生长良好,在传到几十代以后,易聚集成团,且贴壁不牢,用PBS冲洗时即可能脱落,即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液,**好购入时先大量冻存。
4、复苏 293细胞的另一生长特性是贴壁所需时间长且贴壁不牢。细胞冷冻后复苏时,都有不同程度的肿胀,若以50ml培养瓶待细胞长满瓶底的70%~80%时消化冻存,复苏时将其全部接种**2个50ml瓶中时较为合适。刚复苏的293贴壁很慢,复苏接种后24小时内,应尽量减少观察细胞次数或不作观察,以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48小时左右观察贴壁情况并进行**更换培养基比较合适,如果用一次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。
5、转染:体外应用293细胞进行细胞转染时,如果是采用磷酸钙转染,一定要注意293细胞不要全部长满细胞培养盘,长满细胞时加入磷酸钙就会使293细胞大片的脱落,**好是当293生长到1/2或2/3时进行磷酸钙转染,可以避免细胞的大量脱落。
 
其它的经验:1、用大瓶培养较小瓶要好,可能是更有利于293均匀的分布,利于营养的摄取
2、培养液要新鲜,每次只配1000ml,分为2-4瓶,不用的培养液,冻存在-20度,
3、要及时传代,**好是细胞基本铺满培养瓶底部,但是细胞之间还没有完全贴紧,总是多少有空隙的时候**好。
4、如果细胞贴壁不好,可能是消化过久,或是培养瓶不够干净,当然要除外细胞污染。
5、如果使用用玻璃培养瓶或皿,可以采用高压灭菌的0.2%明胶溶液预处理培养瓶/培养皿,方法是将明胶加入培养皿,使之浸泡到底面的各个部分,然后吸出,置超净台内晾干即可使用。这样处理后细胞贴壁效果好且镜下细胞立体感强。如果是新的塑料培养瓶就不用处理。
 
培养基;GIBCO DMEM粉剂,加双抗,HEPES,NaHCO3
配置高糖的DMEM培养基1000ml,
1.一袋DMEM培养基(GIBCOBRL)用去离子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g(终浓度为5mM)
4.加入青霉素10万U(终浓度100u/ml),链霉素6.5万U(终浓度100u/ml)
5.定容900ml
6.过滤除菌、分装到两个消毒的500ml瓶子中
7.加入灭活小牛血清100ml。
 
 
 
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。
 
脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有**终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
五、谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用,合成培养基中都要添加,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解,4℃下放置7天即可分解约50%,所以都是在使用前添加。配制好的培养液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上时,要重新加入原来量的谷氨酰胺,故需单独配制谷氨酰胺,以便临时加入培养液内。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液,即浓度为200mmol/L(29.22g/L),配制时应加温30℃,完全溶解后过滤除菌,分装**小瓶,储存于-20℃。使用时,在每100ml培养液中加入0.5~2ml谷氨酰胺浓缩液,终浓度为1~4mmol/L。

WWW.YIHENG17.COM.CN Corporation of China 2010上海一恒二氧化碳培养箱生化培养箱CO2培养箱恒温培养箱电热恒温鼓风干燥箱 公司简介 联系我们

客服电话
  • 0575-82136325
  • 15157563004