细胞培养注意事项

无菌操作基本技术
1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70 %
ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每
次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间
污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间
隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦
拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操
作。
3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打
开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,
尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒
感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(**少Class II)。操作过程
中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐
针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目:
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300
小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水
 
请问工作浓度的胰酶是不是应保存在-20度?如果放在4度冰箱可以保存多久呢?是不是几个小时就会失去活性?
平时放在-20度,分装在50毫升螺口管,用时拿一管放4度用。
 
1. 认真按照操作规程进行实验,一般不大会导致污染,很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败,

2. 粉末培养基配制好后(加了血清),一般在4度尽量不要超过1个月,如在-20度存放时间可长一些,但**好也不要超过3-4个月,可能对于永生化细胞株来说要求不是太高,但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的,细胞娇弱,经验表明放置时间不宜过长。

3. 关于实验用品的清洗与消毒,我的经验是:用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,然后加少许清洗剂,以超声波洗涤30min左右,(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净),捞出晾干,再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后,自来水清洗10-15遍,双蒸水清洗3-4遍,晾干,高压消毒后即可使用。
许多塑料制品也可以高压消毒,例如培养瓶盖,胶塞,吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了,当然如果money有限,如进口的培养板、皿等,也可以重复使用1-2次,我当时使用方法是将其完全清洁后,使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可,我做过多次,没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便,**好不要重复使用,如一定要重复用,可用环氧乙烷等消毒,(消毒后一定要放置半年以上方可使用)
在光镜下,上皮细胞通常呈“铺路石”样排布,细胞之间有拉丝现象(即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连),细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形,没有有成片生长的特性,细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变,如HeLa细胞是上皮细胞,但是在酸性培养条件下会变为梭形。

上皮细胞之间都有特征性的紧密连接(桥粒)结构,因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型,如果有紧密连接,就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜,要用细胞刮刮下来后做电镜。

此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达(cytokertin, CK),可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子,然后进行免疫细胞化学的鉴定。
 
,细胞在偏碱的情况下培养,耐受能力会逐渐下降,可能是产生脱壁现象的原因,后来我重新测了一下培养基,为7.5左右,我用灭菌的HCL调了一下,培养基颜色变成淡红透亮,再次培养,发现细胞贴壁比较好了,搏动效果也不错,因此,我以后每次培养前都要重新调好PH值,我觉得很多因素是能影响PH值的
 
血清质量不好,影响了细胞生长。所以,我认为以后养细胞,用的血清浓度**好是每批次血清都摸一下,不一定要以参考文献为准,毕竟国产的血清质量差异比较大啊。
 
细胞无菌操作是关键,对于配制培养液时,有些人为了让培养粉充分溶解,搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要,一般培养基的固体组分还是易溶于水的,搅拌的时间长了会增加污染机会,虽然后来滤过除菌了,但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉?细菌的代谢是很快的,甚**在常温下20min就可以繁殖一代,太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。
另外关于培养基的pH问题,一般按照说明书操作,加入所说的NaHCO3量,与预计的pH不会有什么距离,也就是说基本上不用调pH,如果相差大,要考虑三蒸水的质量是否有所下降,当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH,只是用试纸检测一下pH,观察一下培养基的颜色。