细胞培养应注意的问题

1 冷冻管应如何解冻?
取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时, 必须注意安全, 预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基?
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类?
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源, 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。
7 何时须更换培养基?
视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素?
      除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。
9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。
10 悬浮性细胞应如何继代处理?
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可, 若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液**另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释**适当浓度, 重复前述步骤即可。
11 欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?
欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。
12 细胞之接种密度为何?
      依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13 细胞冷冻培养基之成份为何?
动物细胞冷冻保存时**常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?
冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, **次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15 冷冻保存细胞之方法?
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C **–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
16 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
17 应如何避免细胞污染?
      细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之**好方法。
18 如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。
19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
20 支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。