细胞培养程序

材料

A、仪器
1. 净化工作台,2. 离心机,3. 恒温水浴箱,4. 冰箱(4℃)
5. 倒置相差显微镜,6. CO2培养箱,7. 振荡混合仪
8. 酶联免疫检测仪,9. 移液枪,10. 电磁力搅拌机,11. 微孔滤器
B、玻璃器皿
1. 吸管,2. 小烧杯(100ml),3. 废液缸,
C、塑料器皿
1. 吸头,2. 枪头,3. 96孔培养板,4. 15ml离心管,
5. 50ml离心管,6. 胶塞,
D、其他物品
1. 微量加样枪,2. 红血球计数板,
F、试剂
1. D-Hanks液,2. 小牛血清,3. RPMI1640,
4. 双抗(青霉素、链霉素),5. 0.25%胰酶,6.0.025%  EDTA
7. 二甲基亚砜(DMSO),
8. MTT溶液:称取250mgMTT,放入小烧杯中,加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌,分装,4℃保存备用,两周内有效。
一、原代细胞培养或细胞株(系)复苏培养:
(一)细胞原代培养
1.贴壁细胞培养法:
1)、组织块培养法  
将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此,5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴,置青霉素小瓶中,加两滴小牛血清,用剪刀尽可能将其剪碎,用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁,倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置,从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液(小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml),使组织块有培养液与其接触为准,轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。
或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
其他方法:消化分离法  、器官培养  略
2.悬浮细胞培养法  
对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。  
(二)细胞株(系)细胞复苏培养
细胞复苏的主要操作步骤
(1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化。
(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。
(4)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量,如果冻存数量为106,则稀释10倍使细胞达到105即可。
注意事项
在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过**易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生长及形态良好。然而,由于冻存的细胞还受其他因素的影响,有时也会有部分细胞死亡。此时,可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉,再补以适量的新培养液,也会获得较为满意的结果。
二、细胞维持培养(细胞换液培养)、培养选拔常规观察
 (一)原代细胞的维持
1、贴壁细胞(包括半贴壁细胞的换液)  
一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次,其换液方法比较简单,即弃去旧液,加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活,但不需增殖,此时要换成含2%小牛血清的维持液。  待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。
2、悬浮细胞  
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞,需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象,淋巴细胞的短期培养无需换液,但加入生长因子或有丝分裂源(PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等)后,细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖,此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求,加之代谢产物增多,pH变酸,细胞不适宜生长,需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时,都需换液培养,待达到饱和密度时才能传代。换液时,只能采用半量换液的方式,千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下:  
将原培养瓶竖起,在30分钟内,若细胞沉于瓶底,可用吸管轻轻吸去一半上清弃去,再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底,可吸出细胞悬液,采用低速离心(1000r/min 10min)弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基,混匀后再转入原瓶继续培养。  
(二)传代细胞维持培养:同上
(三)培养选拔常规观察:

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