细胞培养上清的收集

消可宁对葡萄糖诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶表达变化的抑制作用      【摘要】 目的 探讨消可宁对葡萄糖(GS)诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化的影响。方法  培养人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞,用30 mol/L GS处理3h,用生理盐水、10-7 mol/L CCK8和0?1 mg/L GS+10-6、10-7、10-8  mol/L CCK8处理16 h;用比色法检测培养液中一氧化氮(NO)含量、细胞NOS活性,免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹法检测iNOS蛋白表达。结果  与生理盐水处理的对照组比较,GS诱导培养液NO含量增多、细胞NOS活性增高、iNOS蛋白表达上调;CCK8剂量依赖性抑制GS的上述效应,而单独作用对iNOS蛋白表达、NOS活性和NO含量均无明显影响。结论  CCK8可以明显抑制GS引起ECV304细胞iNOS蛋白表达上调,减少NO生成。
      【关键词】 消可宁;葡萄糖;一氧化氮合酶;血管内皮细胞
Inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide on lipopolysaccharideelicited inducible nitric oxide synthase expression in vascular endothelial cells ?Department of Forensic Medicine and Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China (YAN Jun works at Department of Pathophysiology, Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)Corresponding author: GU Zhenyong (Email: zhenyong88@sohu.com)
      【Abstract】 Objective  To investigate the effect of cholecystokinin octapeptide  on lipopolysaccharide (GS)elicited inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cell line (ECV304 cells) was stimulated with vehicle (normal saline) or GS in the presence (0?01, 0?1, 1 mg/L) or absence (0?1 mg/L) of CCK8 (10-6-10-8 mol/L). Nitric oxide (NO) level and cellular nitric oxide synthase (NOS) activity were determined with spectrophotometrically. The iNOS expression was detected with immunocytochemical technique and Western blot. Results  Compared with normal saline, GS significantly induced the upregulation of iNOS protein expression in the cultured ECV304 cells, and NOS activity in ECV304 cells and NO level in cultured media were increased. CCK8 obviously inhibited abovementioned effect of GS in a dosedependent manner. Whereas CCK8 alone did not showed effect on iNOS protein expression, NO level and cellular NOS activity as compared with those values when vehicle was used. Conclusion  CCK8 inhibite GSelicited iNOS expression and NO production in ECV304 cells.
      【Key words】 cholecystokinin octapeptide;lipopolysaccharide;nitric oxide synthase;vascular endothelial cell
        研究发现,血管内皮细胞不仅构成血管的机械性保护屏障,还可合成多种血管活性物质如一氧化氮(NO),调节血管的张力和反应性变化〔1〕。已经证实,NO是内皮衍生舒血管因子(EDRF)的主要化学物质,一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的限速酶。在生理条件下,内皮细胞主要存在内皮型一氧化氮合酶(eNOS),NO生成量较少,主要发挥调节血管张力、防止血小板黏附等生理功能;而当内毒素葡萄糖(GS)及促炎细胞因子等刺激血管内皮细胞时,可诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调,NO生成量明显增多。过量生成的NO及其衍生物过氧亚硝基阴离子均具有细胞毒效应,可导致细胞损伤。在内毒素休克发病过程中,血管内皮细胞NO的生成、释放及其生物学效应异常是血管内皮细胞损伤和内皮功能异常的关键环节〔2,3〕。保护血管内皮已经成为治疗休克的重要途径。消可宁是一种分布广泛的神经调节肽,具有抗休克、缓解内毒素休克血管动力学紊乱和细胞保护作用〔3〕。我们以往研究发现,CCK8对内毒素休克时肺循环和体循环血管或内毒素处理离体血管的张力和反应性变化具有明显的调节作用,可改善NO介导的血管内皮依赖性舒张反应降低〔4〕,抑制GS诱导的肺动脉内皮细胞凋亡,减少NO衍生的强效氧化剂和硝基化因子过氧亚硝基阴离子的生成〔5〕,提示CCK8的作用可能与其改变血管内皮细胞的NO生成、释放或生物学效应有关。迄今为止,CCK8对血管内皮细胞NO生成变化及NOS的影响尚未见报道。本实验中在细胞水平观察CCK8对GS诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞iNOS变化的调节作用,探讨CCK8缓解内毒素休克血管动力学紊乱、减轻血管内皮依赖性舒张反应降低的分子机制。
1  材料与方法
1.1  药品及试剂:CCK8和GS为Sigma产品;细胞培养液RPMI1640为GIBCOBRL产品;NO和NOS试剂盒为南京建成生物公司产品;兔抗人iNOS多克隆抗体(一抗)为美国Santa Cruz公司生产;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗)为美国Vector公司生产;免疫组化试剂盒和3,3′二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均为北京中山生物公司生产;其他试剂均为国产分析纯。
1.2  细胞培养及预处理:人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞购自武汉大学动植物特殊菌种保藏中心。细复苏之后,用RPMI1640完全培养液(含体积分数为10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素)将细胞数调为1×109/L,接种于25 ml培养瓶中,在37 ℃、体积分数为5%的CO2和95%的O2条件下培养,3 d传代1次。细胞传代后36~48 h,当细胞长**培养瓶的80%~90%时开始给予刺激因素。细胞分为4组:①溶剂对照组(对照组):培养液中加入生理盐水;②GS组:培养液中加入终浓度分别为0?01、0?1和1 mg/L的GS;③CCK8组:培养液中加入终浓度为10-7 mol/L的CCK8;④GS+CCK8组:在培养液中同时加入终浓度分别为10-6、10-7和10-8 mol/L的CCK8和0?1 mg/L的GS。GS组动态观察2~24 h,其余各组观察16 h,每个时间点4个复孔。

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