动物细胞培养基础实验技术 ——器械的清洗与消毒

实验目的
学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
实验用品:
1.仪器和用品:超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。
2.试剂:75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。
实验内容
1.准备培养用血清瓶(PBS、培养基,约10套,包括20、50ml)、培养瓶(50个)、玻璃滴管(若干)、离心管(10ml)、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。
2.分别包装上述物品,其中血清瓶和瓶盖分别包装,玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。
3.将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。
4.实验室准备。
实验步骤
(一) 清洗
1.玻璃器皿的清洗
浸泡  刷洗  浸酸  冲洗
(1). 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗,再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时,然后用铬酸浸泡过夜,**后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。
(2). 用过之玻璃血清瓶,用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜,**后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。
此外,玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸,培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸,高温灭菌的时候要拧上瓶盖,留有一定的缝隙,灭菌后盖紧。瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住,用绳子扎紧
2.塑料器皿的清洗
自来水充分浸泡  冲洗  2%NaOH浸泡过夜  蒸馏水漂洗3次  2%-5%盐酸浸泡30min   自来水冲洗   晾干  紫外线照射30min
3.胶塞等橡胶类的清洗
自来水冲洗  2%NaOH  煮沸15min 自来水冲洗 蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上
2%-5%HCl煮沸15min  晾干  晾干后高压灭菌
4.金属器械的清洗
新购置的器械
用过的器械
(二)包 装
分为局部包装和全包装。
为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。
按照不同类别进行包装。
(三)消毒灭菌
主要包括物理法和化学法。
  物理法:热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。
 化学法:应用化学制品进行消毒灭菌。
(四)无菌室和操作野消毒
无菌室内每周用乳酸蒸气(或过氧乙酸)加紫外线消毒1-2次。实验前,将实验器材放入超净台内,打开超净台紫外灯,同时启动超净台风机,40min后消毒完毕,关闭紫外线灯。这样,超净台内空气被净化,超净台面构成相对无菌的环境。
或无菌室:每周用75%酒精擦洗后紫外灭菌。

实验 培养基的配制及细胞培养的条件

一、培养基的特性-细胞生存的环境与条件
1温度条件(37 0.5)
2 pH条件 (7.2-7.4)
3气体条件
4水的质量(三蒸)
5渗透压
6营养条件
7无菌条件℃
二、 培养基的分类
1平衡盐液
2天然培养基(小牛血清、胚胎液)
3合成培养基(化学成分清楚)
三、 RPMI1640培养基的配制
1、RPMI1640 10 g
2、丙酮酸钠 0.11 g
3、Hepes(羟乙基哌碃乙硫磺酸) 5.925 g
4、NaHCO3  2 g
5、三蒸水 1000 mL
四、 过滤出菌
    仪器:不锈钢正压滤器
    材料:纤维素微孔虑膜 (0.22 mm 孔径)
装好后消毒
五、 完全培养基的配制
RPMI 1640 培养液   85 mL
小牛血清             10 mL
谷氨酰氨             1 mL
抗菌素(青、链霉素) 1万单位 1 mL

实验动物细胞连续传代培养(SP2/0细胞)

一、实验目的:
1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞;
2、杂交瘤细胞的扩大培养(种腹水),或传代培养。
二、实验原理:
小鼠骨髓效力细胞株(NSI,SP2/0)和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力,它们都属于半贴壁细胞,不用胰蛋白酶或EDTA消化液,只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养,以为实验提供生长旺盛的细胞(对数生长期的细胞)。
三、实验材料:
SP2/0细胞(或杂交瘤细胞)
CO2培养箱、细胞培养瓶(25、50、100毫升)、弯头滴管、消毒用套筒(玻璃或铜质)、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。
四、实验步骤:
1、复苏的或转瓶的传代细胞,使细胞浓度大约为5×104/毫升,置37℃5%CO2培养箱中培养。
2、培养48小时后,可见部分细胞贴壁生长,而部分细胞呈漂浮状态,可用滴管吸去漂浮的细胞,加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。
3、若细胞生长过密,则需及时冲下并吸出部分细胞,或将吸出的细胞转瓶扩大培养,如果不是这样处理,细胞很易出现衰老、死亡现象,对于杂交瘤来讲,这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。
4、用于细胞融合的骨髓细胞,必须在生长繁殖的对数期(约105细胞/毫升),而且细胞形态规则要一致(圆而亮,有一定的立体感),机能要活跃,活细胞数在90—95%以上。要得到这种细胞,其培养技巧在于,在融合前24小时,将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来,并除去1/2或更多的细胞,加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。

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