Assay Protocol——细胞培养

一、仪器、试剂
    仪器:细胞培养瓶,移液枪,枪头盒(5ml、1ml、100μl、10μl),移液管(5ml、10ml),玻璃分装瓶(100ml、200ml、500ml),高压铝盒(离心管、冻存管),离心机(800转5min),倒置显微镜,细胞计数板,水浴箱(37℃), CO2培养箱(调整**37℃、5%CO2)。
试剂:DMEM,Serum,Trypsin,P.S.,Puromycin,DMSO。
二、试剂配制
10ml Complete Media:DMEM 9ml;
                    Serum 1ml;
                    P.s. 100μl.
10ml Frozen Media:Complete Media 8ml;
                  Serum 1ml;
                  DMSO 1ml。
Puromycin(2μg/μl):6μlPromycin/4ml CM
三、具体操作
1. 准备:取各种已消毒的培养用品(枪头盒、高压铝盒、分装瓶)置于净化台面,紫外线消毒30分钟,Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin从4℃冷藏拿出**室温待用(使用之前用75%酒精全面消毒)。开始工作前先洗手、戴上乳胶手套,用75%酒精喷拭手**肘部。
    紫外灭菌时间到后,将灯和风机打开,开始工作。将Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin去除封口处密封条,用75%酒精喷拭全面消毒后拿进去待用(注意:使用之前,应充分摇匀)。合理摆放所需物品,尽量减少手部的大幅度摆动,点燃酒精灯,配置100ml Complete Media:用10ml移液管吸取DMEM 10ml*9次**分装瓶中,再吸取Serum 10ml**分装瓶中,再加入1ml P.S.用移液管吹打混匀后待用。
2. 辛 将待处理细胞取出后,倒掉原有的培养基;
   安装5ml移液枪头后吸取PBS 5ml,每支细胞加入2.5ml,清洗细胞代谢物和培养瓶底部(清洗不干净会使胰酶消化变难),清洗过后倒掉PBS(垂直倾斜瓶各倒一次,一定要倒干净,防止残余PBS稀释Trypsin,影响酶解效果)。
   然后,每支细胞加入0.5ml Trypsin,摇摆培养瓶使其充分覆盖瓶底,待每一支培养瓶都加入Trypsin摇匀后,再从**支开始,用力拍打培养瓶,左右摇摆使细胞都被消化下来,不在贴壁,依次拍打各支细胞,观察,使其全部都消化完全(注意:控制消化时间不要太久,把握不好就要再显微镜下观察)。然后再加入3倍体积的Media 1.5ml于培养瓶中,终止其消化。再确保枪头无污染的前提下,同一种细胞可以用同一个枪头来吹打细胞(仔细吹打培养瓶,尤其是边边角角),使其成为单细胞悬液。
3. 提前用镊子准备出4ml离心管,对应每一支细胞,做好标记。再细胞吹打完全后,用移液枪将细胞悬液转移**离心管中,用密封条封好口。待所有细胞都转移**离心管后,①将待冻存的细胞放置于准备好的碎冰中保存待用(合理放置防止染菌);②将用于分瓶传代的细胞先800转离心5min(离心过程中,每一支培养瓶中加入3.5ml Media)后取出,去除封口膜,用酒精喷拭后(确保密封),打开瓶盖后烧瓶口灭菌,小心倒掉上清后烧瓶口灭菌,然后加入1ml或1.5ml Media吹打均匀(注意:不要产生大量气泡)后,对应各自的培养瓶,均匀的进行一分二或一分三传代,摇晃均匀,观察后,放入CO2培养箱中继续培养。
4. 将①等待冻存的细胞悬液,进行800转离心5min。在此期间,配制冻存液ep:10ml,可在用完的serum15ml离心管中,加入8ml Media,1ml serum,1ml DMSO,吹打混匀后待用;然后用镊子取出对应的n支冻存管,做好标记(名称、日期、作者姓名首字母缩写)。
离心结束后,取出离心管,去除封口膜,用酒精喷拭后(确保密封),打开瓶盖后烧瓶口灭菌,小心倒掉上清后,烧瓶口灭菌,然后加入2ml配好的冻存液,吹打均匀后,进行1分2的冻存,待所有细胞处理完全后,先**于-20℃中等待,然后转移**-80℃冰箱中保存,并做好冻存记录。
注意事项:  
1、严格无菌操作,打开/拧上瓶盖时一定要烧瓶口灭菌。
2.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面,并靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌。
4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。
 
四、细胞的冻存(补充)
1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。
2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱(可保存半年)中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
5同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
6.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。
补充1:              细胞复苏的原则
快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化**37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

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