比较细胞工厂与10L转瓶培养Vero细胞和产毒情况

一、实验目的
1、了解熟悉细胞工厂的使用,清洗及再利用的方法;
2、比较细胞工厂与10L转瓶同等条件下培养Vero细胞时各自细胞的生长状态;
3、比较细胞工厂与10L转瓶培养Vero细胞加毒之后细胞的状态变化和产毒情况;
4、通过实验分析用细胞工厂代替原有转瓶生产优缺点;
5、通过实验发现细胞工厂中常见问题。
二、主要实验工具及材料
干净的10L转瓶一个(表面积约为2278㎝2);
NUNC公司4层细胞工厂一个(表面积为2520㎝2,编号:140360),自带一个插拔塞和旋口塞
细胞生长液;细胞维持液;毒种(CTN-1V株工作种子批毒种)
三、实验过程
(一)培养Vero细胞,观察分析及注意事项
将一瓶已长成致密单层细胞消化,制备成细胞悬液,计数后,按照每ml溶液含有1×105个细胞数,及每平方厘米贴壁细胞数相同,根据面积比计算出加入ml数。加入细胞后放置于37℃恒温室中培养。
细胞悬液浓度:2.32×106个/ml
 
  溶液总体积(ml) 加入细胞悬液体积(ml) 面积细胞数(个/cm2)
细胞工厂 800 34.48  
10L转瓶 1500 31.03  
 
观察、分析
2010-8-5
11:00   加入细胞和培养液于细胞工厂和10L转瓶中培养
13:30   观察:细胞工厂中的贴壁细胞数量较10L转瓶多,溶液中含有大量的悬浮细胞
分析:细胞工厂是静置培养,细胞贴壁较10L转瓶快
 
2010-8-6
9:10观察
细胞工厂:细胞状态良好,已伸展,分布均匀
10L瓶:细胞状态一般,少许伸展,分布稍有不均
分析:10L转瓶中的细胞贴壁不均匀,可能是由于细胞总数较少造成
 
(二)加入病毒后,Vero细胞状态的观察分析
2010-8-9
9:30观察(加毒前)
细胞工厂:细胞生长成致密单层,间隙很小,排列整齐,分布均匀
10L转瓶:细胞生长成致密单层,间隙很小,排列较整齐,分布稍有不均匀
 
加毒前更换培养液为维持液,再根据比例加入3.1ml(10L转瓶)3.4ml(细胞工厂)病毒
 
2010-8-10  9:00观察
细胞工厂与转瓶中的细胞无明显变化,状态正常,轮廓清晰
 
2010-8-11  9:30观察
细胞工厂与转瓶中的细胞状态正常,无明显病变,无悬浮细胞;10L转瓶的颜色稍浅
 
2010-8-12  9:00观察
细胞工厂与转瓶中的细胞局问成拉网状,有少量悬浮细胞出现,并且细胞工厂中的悬浮细胞较10L转瓶多,细胞工厂中的PH维持正常,颜色无变化,10L转瓶的PH维持不好,颜色变化明显,PH下降明显。
分析:细胞工厂较10L瓶透气性好,所以PH维持得好
 
2010-8-13  9:15观察
细胞工厂与转瓶中的悬浮细胞数量增多,大部分细胞病变明显,成拉网状
 
(三)收获病毒液
2010-8-16  9:30收获病毒液前观察
细胞工厂与10L转瓶中有大量的悬浮细胞,考虑收获病毒液。
收获病毒液取样:分别从细胞工厂和10L转瓶中取样于青霉素小瓶中,送样检测抗原和感染性滴度
 
四、实验结果分析
抗原结果和滴度结果
此次实验结果显示,细胞工厂制备的狂犬病毒液,抗的含量和感染性滴度均好于转瓶工艺制备的病毒液。可能与下述原因有一定关系:
(1)细胞工厂为静止培养法,接种细胞后细胞贴壁良好,分布与较均匀,而转瓶细胞贴壁时间较长,并且稍有不均,因此在一定时间内,细胞工厂细胞长势稍好一些;
(2)10L瓶的细胞表面积少于细胞工厂,接种的细胞数是按面积计算,细胞工厂总细胞数多于转瓶培养的细胞数;
(3)转瓶工艺加毒时维持液1500ml,细胞工厂维持液是800ml。
因此,细胞工厂制备的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于转瓶工艺
在现有的条件下,很难找到与细胞工厂细胞生长面积和维持液体积一致的对照方法,只能以细胞附着的单位面积,加入细胞数条件控制,但维持液的量则无法控制,只能按常规方法加入。
 
细胞工厂每层液面均分操作:
1、将培养基直接倒入细胞工厂;
2、将细胞工厂朝有小口的一面放置,平衡一段时间;
3、将细胞工厂翻转90度,带有进液口的一面朝上,静置一段时间,培养基便会自动平均分配到每一层腔室中;
4、双手握住进液口的一面,缓慢地将细胞工厂放倒,变成水平放置,不要抓握**层边缘,以防造成损坏。
 
注意事项:
1、移动细胞工厂的时候要尽量保持水平,否则会造成每层溶液不均匀;

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