细胞培养基础

1、细胞(组织)培养年鉴 
1878 Claude Bernard:证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。
1885 Wilhelm Roux:在一个生理溶液中维持一快鸡胚的活性并观察其发育,从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。
1887 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基,在体外培养青蛙神经嵴,维持其活性达数星期,并观察到了神经纤维的生长,从解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。
1910 Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.
1911 Lewis & Lewis:由海水、血清、胚胎提取物和盐和蛋白胨为原料配制成了**个人工的细胞培养液,并观察到了单层细胞的有限生长。
1916 Rous & Jones:开创使用胰酶来收获贴壁生长的细胞。
1923-1931 Carrel & Baker:研制T型培养瓶大规模培养细胞。
1927 Carrel & Rivera:制造了**个病毒疫苗:牛痘疫苗。
1933 Gey: 发明了转管培养细胞的技术。
1948 Fisher: 研制成了**个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006,该培养液**今还在使用。
1952 Gey 和同事:分离培养了Hela细胞。
1952 Dulbecco:发明了噬斑法,用长满的单层细胞检测病毒。
1954 Abercrombie: 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。
1961 Hatflick & Moorhead:显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。
1965 Ham:配制了**个无血清培养液。
1975 Kohler & Miltein:成功的得到了**个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。
2、怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件?
ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数常用细胞的详细资料。
打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接,输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。
数据库中有每一种细胞的详细描述,包括细胞的来源,培养和冻存条件,显微形态以及相关文献等资料。
3、为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱?
一般细胞培养液的pH在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统(它是人体血液中**重要的pH缓冲系统),所以大多数培养液用它来保持稳定的pH。用粉末配制培养液时,常常需要加入一定量的碳酸氢钠。
对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言,以为了维持稳定的pH,培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间,以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气,以便于气体的交换。
是不是采用其他pH缓冲系统就不需要二氧化碳培养箱了呢?人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低,如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养,培养液中的HCO3-会被耗尽,这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养,还是需要二氧化碳培养箱。
细胞培养液中常附加其他的pH缓冲系统,比如HEPES缓冲系统,来增加pH缓冲能力。HEPES在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力,当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候,由于空气中二氧化碳浓度很低,培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果,这时候HEPES缓冲系统就能继续保持pH的稳定。
4、二氧化碳培养箱的挑选和使用
由于动物细胞培养液一般使用碳酸盐pH缓冲系统,要求培养环境中维持一定浓度的CO2,所以动物细胞的培养一般需要CO2培养箱
CO2培养箱采用两种不同的CO2维持系统。一种方式是通过使用空气泵,将CO2和空气按一定比例混合后吹入培养箱。另一种方式是通过一个自动的CO2检测控制系统,在检测到CO2浓度低于要求浓度时打开CO2气阀充入CO2。由于前一种方法耗费CO2而且不容易精确控制CO2浓度,先进的CO2培养箱都采用自动监控系统来维持CO2的浓度。
配有自动CO2检测控制系统的培养箱需要根据生产厂家的说明,定期做CO2浓度的测试和矫正,防止因为零点漂移而导致CO2显示浓度和实际浓度不一致。
CO2培养箱的隔热采用水套式和气套式两种类型。水套式需要用户在安装培养箱时培养箱壁的空间内灌入大量蒸馏水。由于水的比热容很高,水套式的优点是有助于均匀散热和避免形成冷区,以及在断电后能够比较好的减缓培养箱内温度的降低。它的缺点是由于灌入大量的水,培养箱变得非常沉重,不易搬动。有效的隔热系统和先进的表面散热元件的使用使气套式培养箱兼备了轻便性和水套式培养箱的优点,所以新型的CO2培养箱大多采用气套式。
目前大多数实验室都使用进口的细胞培养箱。虽然进口的产品质量上比较有保障,但价格很贵,而且售后服务不是很方便。国内的细胞培养箱的质量也有了很大的提高,价格低,售后服务也比较方便(笔者目前使用的二氧化碳培养箱是长沙长锦科技的,质量和售后服务都不错)。
CO2培养箱一般配一个水盘,用以维持很高的湿度。水盘内的水要定期添加,水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。
为了减少微生物的污染,有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌,有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌,这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。
5、超净台的挑选和使用
为了避免污染,一般的细胞培养需要在超净台上进行。用于细胞培养的超净台的洁净度一般为100级,即每立方英尺中大于0.5um的颗粒数量少于100颗,与计算机硬盘的生产环境要求相当。

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