细胞培养注意事项问题解答


       细胞培养技术解答
一、细胞培养基础问答
 
1.BHK细胞就是指BHK21吗?
    答:BHK细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney),1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞,贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长,它广泛用于增殖各种病毒,生产兽用疫苗。**常用的是BHK21的一个亚克隆细胞,即克隆13或C13 。
2.二倍体细胞有什么特点?
   答:二倍体细胞的染色体组型是2n核型;贴壁依赖接触抑制;一般可传代50代;无致瘤性。如W1-38:正常胚肺组织人二倍体细胞系。MRC-5:从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。
3.什么是动物细胞大规模培养?
    答:所谓动物细胞大规模培养技术(large-scale culture technology)是指在人工条件下(设定pH、温度、溶氧等),在细胞生物反应器(bioreactor)中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、CHO(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞)等,并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
    在过去几十年来,细胞培养技术经有了很大发展,从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube等贴壁细胞培养,发展为生物反应器(Bioreactor)进行大规模细胞培养。
4.细胞体内外培养的差别是什么?
    答:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中,日久天长,易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后,这种差异就开始发生了。
5.什么是无血清培养基?与普通培养基有什么区别?
    答:无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。
6.什么是无血清无动物组分培养基、无蛋白培养基和限定化学成分培养基?
    答:无血清无动物组分培养基是不含任何动物来源成份的无血清培养基,但可能添加植物蛋白或重组蛋白。无蛋白培养基(protein free midium,PFM):即不含有蛋白的培养基,无论是植物蛋白或动物蛋白。成分培养基(chemical defined medium,CDM):是指培养基中的素有成分都是明确的,它同样不含有蛋白,也不是添加了植物水解物,而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物和产品纯化。
7.HEPES在细胞培养过程中起什么作用?
    答:HEPES溶液:是一种弱酸,中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸,主要作用是防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下,观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境,CO2气体迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。
8.CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?
答:定期(**少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
二、 培养基生产和使用常见问题
1.低血清培养基能用肉眼判断其pH值吗?
   答:低血清培养基中酚红的含量与普通培养基中的酚红含量不同,不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值,建议使用pH计进行测定。
2.低血清培养基的缓冲系统是什么?
   答:平衡盐一般是由无机盐及葡萄糖组成的。平衡盐有Hanks′系统、Earle′s系统、Dulbecco′s磷酸缓冲盐系统等。199系列培养基、MEM系列培养基均有Hanks′系统的培养基及Earle′s系统的培养基。但是有些培养基均不是以上常规的平衡盐系统,例如RPMI 1640培养基、F12培养基。MEM(SLM)低血清培养基的平衡盐系统也不是常规的平衡盐系统,该平衡盐系统的缓冲能力强于常规平衡盐系统的缓冲能力。
3.谷氨酰胺溶液和碳酸氢钠的配制方法是什么?
   答:以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制为例:称取L-谷氨酰胺2.92g,加注射用水100ml,充分搅拌混匀。用0.2μm滤膜正压过滤除菌。溶液应在4℃下避光保存,2周内使用。以7.5% NaHCO3的配制为例:称取NaHCO37.5g溶于100ml蒸馏水中过滤除菌。
4.什么培养基中可以省去加酚红?
   答:酚红在培养基中用作pH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响,可以通过纯化技术去除,但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡,影响细胞生长,当然这种作用能被血清所中和或减轻。酚红并不是培养基中必需的一种成分,很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。
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